Développements technologiques et méthodologiques Frédéric PRZYBILLA et Ludovic RICHERT

Axe 3. Développements technologiques et méthodologiques  Responsables : Frédéric PRZYBILLA et Ludovic RICHERT

Cet axe transversal vise à répondre aux besoins en microscopie du laboratoire et s’inscrit dans notre participation en tant qu’équipe R&D du noeud Alsace de France Bioimaging. Notre objectif est de développer de nouvelles modalités d’imagerie optique à la pointe de la technologie et de nouvelles sondes fluorescentes capables d’apporter des réponses décisives aux questions en biologie de l’équipe et de l’UMR.

Nous avons acquis une forte expertise dans les approches quantitatives de microscopie : les F-Techniques (FLIM/FC(C)S)1 et les caractérisations à l’échelle de la molécule unique (smFRET (single molecule FRET), SPT (single particle tracking), SMLM (Single Molecule Localization Microscopy)2 pour l’étude des dynamiques et interactions biomoléculaires (protéine-protéine, acide nucléique/protéine, lipide/protéine). Après les phases de prototypage et validation des nouveaux instruments, ces derniers sont progressivement intégrés à la plateforme QuESt-IBiSA pour les rendre accessibles à la communauté scientifique académique et industrielle. Nous avons ainsi déjà développé un microscope multiphoton FLIM (fluorescence lifetime microscopy)/FCCS (fluorescence cross correlation spectroscopy),3,4 2 microscopes de super-résolution (3D PALM/dSTORM et un système de λ-PAINT),5,6 un microscope champ large et un microscope confocal dédié à la conversion ascendante de photons respectivement optimisé pour le SPT cellulaire et imagerie PLIM (phosphorescence lifetime imaging).7,8

Sur la base de cette expertise et des nouveaux besoins des autres axes de l’équipe et du laboratoire, plusieurs développements seront menés tant en optimisant les instruments existants qu’en développant de nouvelles approches.

Biophysique des acides nucléiques en solution et milieu cellulaire

Dans le cadre du suivi des interactions biomoléculaires avec les acides nucléiques et de l’expertise de l’équipe sur la caractérisation et l’utilisation d’analogues fluorescents de guanosine (axe 1), un système de suivi en molécule unique optimisé pour des oligonucléotides marqués par ces analogues est actuellement en développement. Ces sondes présentant un maximum d’absorption entre 300 et 400 nm, nous avons utilisé une architecture prism-TIRF combinée à des approches plasmoniques pour optimiser l’excitation des sondes et leur rapport signal sur bruit. Par ailleurs, pour étudier des ARN/ADN dans un contexte cellulaire à l’aide de ces mêmes analogues (axes 1 et 2), nous développons en parallèle un microscope FLIM avec une excitation pulsée UV, en mettant à profit les temps de vie de fluorescence particulièrement longs (> 10 ns) de ces analogues. Des tests préliminaires ont montré la preuve de principe de l’imagerie temporelle qui nous a permis de discriminer ces analogues de guanosine de l'autofluorescence cellulaire. Notre objectif est d'ouvrir une nouvelle ère où des acides nucléiques fluorescents fonctionnels peuvent être imagés et suivis dans des cellules vivantes.

Légende : Biophysique des acides nucléiques via imagerie d’analogues fluorescents de guanosine en solution et milieu cellulaire. (a) Analogue fluorescent de guanosine. (b) Photographie du microscope smFRET UV pour l’étude à l’échelle de la molécule unique des analogues fluorescents, (c) Exemple d'image fluorescente résolue en temps et seuillage temporel de l'internalisation de la thG dans des cellules vivantes.

Interactions biomoléculaires en solution

Sur la base de son expertise dans la caractérisation des interactions macromoléculaires (protéines, acides nucléiques) par des approches de fluorescence, l’équipe a mis en place un microscope smFRET pour suivre la dynamique d’interaction et les changements de conformation des protéines à l’échelle d’une seule molécule. L’instrument, basé sur un microscope TIRF (total internal reflexion fluorescence), permet le suivi d’un grand nombre de molécules uniques simultanément sur un lapse de temps long. Toutefois, cette approche nécessite l’immobilisation en surface d’un des partenaires et ne permet de résoudre que des temps de transitions entre conformations supérieurs à la ms. Certaines interactions moléculaires ne sont pas compatibles avec ces limitations, ce qui nous conduit à développer un microscope smFRET en microscopie confocale avec une excitation laser alternée (ALEX) comme outil complémentaire. Cette approche permet de suivre les interactions directement en solution avec une résolution temporelle de l’ordre de la μs.

Un autre axe de développement porte sur la conception et validation de rotors moléculaires fluorescents (FMR) pour caractériser les interactions biomoléculaires en solution. Les FMR sont des molécules organiques aromatiques flexibles devenant très émissives dans un milieu rigide où leur rotation intramoléculaire est restreinte. Cette caractéristique des FMR peut être exploitée pour suivre les modifications de leur microenvironnement moléculaire en observant les changements de leur intensité et durée de vie de fluorescence. Nous nous focalisons sur i) l’ajustement fin des propriétés physicochimiques et photophysiques de FMR sélectionnés en modifiant chimiquement leur structure et ii) le développement de nouvelles approches chémoenzymatiques pour l'incorporation sélective de FMR dans les ARN. Notre objectif est d'obtenir et valider des FMR de nouvelle génération pour suivre les interactions des G4 avec leurs protéines cibles et étudier la formation et l'organisation interne de systèmes microhétérogènes, tels que des gouttelettes à phases séparées formées d'ARN et de protéines de liaison à l'ARN. Ces sondes seront également utilisées par l’équipe MPB pour étudier la séparation de phase liquide-liquide.

Suivi de molécules uniques et organisation membranaire

Dans le cadre de l’étude de la dynamique des lipides à la surface de cellules vivantes (axe 2), nous avons déjà montré que les marquages à base d’UCNPs permettaient d’obtenir en SPT des trajectoires qui ne sont plus limitées par la photophysique du marqueur mais uniquement par la dynamique du système (déplacement de la particule hors du champ).9 Pour tirer pleinement profit de la photostabilité des UCNPs, nous implémentons le suivi en temps réel et en 3D d'une particule unique par boucle de rétroaction afin de maintenir une particule d'intérêt dans le volume de détection. Cette approche permet de suivre des trajectoires SPT très longues qui donnent des informations inédites sur la dynamique à long terme des lipides à la surface de cellules vivantes. De plus, cette méthode permet de réaliser des mesures spectroscopiques simultanées dans une approche de type λ-PAINT, ce qui permet d’exploiter les capacités de multiplexage des UCNPs. En effet, les spectres des UCNPs sont constitués de bandes d'émission fines bien séparées dont les rapports et les positions dépendent de leur composition. Cette caractéristique permet sur un même échantillon de suivre simultanément la dynamique de plusieurs types de lipides d’une même cellule. Finalement, ces expériences fourniront une description sans précédente de la dynamique et l'organisation de la membrane plasmique et pourront être appliquées à d’autres systèmes.

 

Légende : Dynamique de l’organisation membranaire sur le long terme par suivi de molécules uniques 3D (SPT) (a) Cette image de ciel étoilé est en fait l’émission anti-Stokes des UCNPs lorsqu’elles sont éclairées par un faisceau laser infrarouge. (b) Image de microscopie en champ clair des cellules étudiées avec en incrustation les trajectoires super-résolues de récepteurs membranaires uniques obtenues après analyse des vidéos.

Imagerie multicouleurs en super-résolution

Nous avons développé une nouvelle modalité d’image super-résolue appelée DRET-PAINT (dark resonance energy transfer PAINT), qui utilise comme donneur de FRET une sonde à très faible rendement quantique de fluorescence (développée par A. Burger, Université de Nice) en association avec un accepteur très brillant. En intégrant cette sonde dans un oligonucléotide imageur, nous avons pu montrer que la reconnaissance d’un brin complémentaire marqué à l’accepteur induisait l’allumage de ce dernier, tout en maintenant un bruit de fond minimal. Cette technique constitue une optimisation de l’imagerie PAINT, qui devrait permettre une imagerie multi-couleurs à haute résolution (< 60 nm) avec des temps d’acquisition courts (< 5 min). Elle sera notamment appliquée dans les thématiques de l’axe 2.

Légende : Imagerie multicouleurs en super-résolution. (a) Nouvelle sonde DFK utilisée comme donneur de FRET. (b) Principe du dark resonance energy transfer PAINT (DRET-PAINT). (c) Image super-résolue du réseau de microtubules au sein de cellules HELA (en rouge l’image TIRF et en vert l’image DRET-PAINT) (encart) Zoom sur une branche du réseau de microtubule.

1.            Anton, H., Taha, N., Boutant, E., Richert, L., Khatter, H., Klaholz, B., Rondé, P., Réal, E., Rocquigny, H. de & Mély, Y. Investigating the Cellular Distribution and Interactions of HIV-1 Nucleocapsid Protein by Quantitative Fluorescence Microscopy. PLOS ONE10, e0116921 (2015).

2.            Glushonkov, O., Réal, E., Boutant, E., Mély, Y. & Didier, P. Optimized protocol for combined PALM-dSTORM imaging. Scientific Reports8, (2018).

3.            El Meshri, S. E., Dujardin, D., Godet, J., Richert, L., Boudier, C., Darlix, J. L., Didier, P., Mély, Y. & de Rocquigny, H. Role of the Nucleocapsid Domain in HIV-1 Gag Oligomerization and Trafficking to the Plasma Membrane: A Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Investigation. Journal of Molecular Biology427, 1480–1494 (2015).

4.            Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., Steffan, T., Gasser, V., Boutant, E., Réal, É., Schalk, I. J., Mély, Y. & Godet, J. FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria. JoVE 61602 (2020). doi:10.3791/61602

5.            Manko, H., Mély, Y. & Godet, J. Advancing Spectrally‐Resolved Single Molecule Localization Microscopy with Deep Learning. Small19, 2300728 (2023).

6.            Manko, H., Burton, M. G., Mély, Y. & Godet, J. Spectral Phasor Applied to Spectrally‐Resolved Single Molecule Localization Microscopy. ChemPhysChem25, e202400101 (2024).

7.            Dukhno, O., Przybilla, F., Muhr, V., Buchner, M., Hirsch, T. & Mély, Y. Time-dependent luminescence loss for individual upconversion nanoparticles upon dilution in aqueous solution. Nanoscale10, 15904–15910 (2018).

8.            Frenzel, F., Würth, C., Dukhno, O., Przybilla, F., Wiesholler, L. M., Muhr, V., Hirsch, T., Mély, Y. & Resch-Genger, U. Multiband emission from single β-NaYF4(Yb,Er) nanoparticles at high excitation power densities and comparison to ensemble studies. Nano Res.14, 4107–4115 (2021).

9.            Dukhno, O., Ghosh, S., Greiner, V., Bou, S., Godet, J., Muhr, V., Buchner, M., Hirsch, T., Mély, Y. & Przybilla, F. Targeted Single Particle Tracking with Upconverting Nanoparticles. ACS Appl. Mater. Interfaces16, 11217–11227 (2024).