Structure et dynamique de membranes cellulaires et de nanoparticules lipidiques Frédéric PRZYBILLA et Toshihide KOBAYASHI

Au sein d’une membrane, la composition lipidique des feuillets externe et interne de la bicouche lipidique est différente et présente des hétérogénéités. La façon dont cette asymétrie/hétérogénéité est construite, maintenue et régulée reste mal comprise, tout comme son rôle. Nous avons développé une large palette d’outils innovants (sondes, protocoles, équipements) qui permet de caractériser et suivre ces organisations lipidiques in situ. En particulier, nous avons développé une série de sondes protéiques se liant spécifiquement à des lipides (LBPs pour lipid binding proteins) pour visualiser la distribution des lipides endogènes à l'échelle nanométrique.^1,2 Notre objectif est d’utiliser ces LBPs pour étudier les mécanismes moléculaires régulant la distribution des lipides ainsi que leurs dynamiques. Nous couplerons également les LBPs à des nanoparticules à conversion ascendante (UCNPs pour up-converting nanoparticles) pour suivre la dynamique à long terme de nano domaines lipidiques (NDLs). Enfin, nous caractériserons la structure et le devenir intracellulaire de nanoparticules lipidiques encapsulant des ARNm (LNPs pour lipid nano-particles) utilisées en stratégie vaccinale.

Découvrir comment VIH-1 assemble l’enveloppe lipidique qui lui permet d’entrer dans ses cellules cibles

L'enveloppe lipidique du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est formée lors de l’étape de bourgeonnement au niveau de la membrane plasmique des cellules hôtes infectées. Il est intéressant de noter que le VIH-1 sélectionne un ensemble spécifique de lipides tels que la sphingomyéline (SM) et le cholestérol (Chol), qui sont importants pour l'activité du virus. La protéine virale Gag joue un rôle central dans le bourgeonnement du virus. Différentes techniques de microscopie quantitative et à super-résolution en combinaison avec des LBPs spécifiques de SM et de Chol ont révélé que lors de son expression dans une cellule, Gag recrute SM et Chol et induit la fusion de domaines riches en SM et en Chol.³ Le SM est distribué dans le feuillet externe de la membrane plasmique tandis que Gag se lie au lipide du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P₂) dans le feuillet interne. Ainsi, la communication entre les lipides du feuillet externe et interne est cruciale pour le recrutement des lipides par Gag. Cependant, on sait peu de choses sur la communication lipidique interbicouche dans les biomembranes. En utilisant la génétique moléculaire et diverses LBPs, nous étudierons les mécanismes moléculaires qui régulent la communication lipidique inter-feuillets. Notre étude découvrira comment le VIH-1 assemble son enveloppe lipidique et fournira également des informations essentielles sur la transduction du signal par la membrane.

Nanoparticules à conversion ascendante pour l’étude à long terme de la dynamique des domaines lipidiques à la surface de cellules vivantes

 Les mécanismes régissant et régulant l’hétérogénéité lipidique des membranes sont mal connus en raison notamment des difficultés pour visualiser et suivre les nanodomaines lipidiques (LNDs) petits et très dynamiques. Le suivi de particule unique (SPT) est une technique puissante pour étudier la dynamique et l'organisation des membranes, mais elle est limitée par le manque de sondes disponibles pour l'observation de lipides et LNDs endogènes avec une bonne résolution spatio-temporelle sur de longues échelles de temps. Pour répondre à ces défis, nous développons des sondes SMT combinant des UCNPs et des LBPs capables de reconnaître les LNDs. Les UCNPs par leur émission anti-Stokes présentent toutes les propriétés d'un marqueur idéal pour les études SMT à long terme en raison de leur (i) SNR élevé, (ii) émission continue, (iii) photostabilité, (iv) petite taille et (v) faible phototoxicité.^4–6 Pour atteindre notre objectif, nous utiliserons des UCNPs enrobés par des phospholipides pour garantir une bonne stabilité colloïdale et chimique ainsi qu'une forte brillance en solution aqueuse tout en limitant leur adsorption non spécifique aux cellules. Les sondes UCNP-LBPs permettront d’étudier la dynamique des lipides et domaines lipidiques à la surface de cellules vivantes. Des études avec différentes cellules pathologiques présentant une composition membranaire altérée fourniront des informations complémentaires sur les rôles de la SM et du cholestérol dans la formation et la dynamique des LNDs ainsi que sur les altérations de la membrane liées à la maladie.

Caractérisation et suivi du devenir intracellulaire de nanoparticules lipidiques (LNP) délivrant de l'ARNm

Les thérapies basées sur les ARNm sont très prometteuses pour traiter un large éventail de maladies. Pour délivrer les ARNm dans les cellules, les nanoparticules lipidiques (LNPs) sont les plateformes les plus avancées, mais leur architecture et leur évolution durant leur trafic intracellulaire (endocytose, échappement endosomal, reconversion en des vésicules extracellulaires) restent peu claires. Avec notre boîte à outils dédiée à l'étude des lipides, nous proposons de caractériser leur organisation interne (lipides et ARNm) et suivre l'évolution de cette organisation au cours des différentes étapes de leur vie intracellulaire. Avec des sondes fluorescentes sensibles à l’environnement, nous pourrons suivre les propriétés physico-chimiques des LNPs avec les LBPs ainsi que la distribution des lipides au sein des LNPs dans le cytoplasme. En outre, nous marquerons les ARNm par thG et tzG (étudiés dans l'axe 1) pour suivre leur destin intracellulaire sans altérer la structure des LNPs. Le suivi simultané de l'ARNm et de l’organisation lipidique à toutes les étapes cellulaires n'a jamais été réalisé auparavant et devrait permettre d'évaluer l'impact de changements de composition des LNPs et de facteurs externes, tels que les conditions de stockage, sur l'efficacité de la délivrance de l'ARNm. Ceci devrait ainsi aider à concevoir des vaccins optimisés.

Légende : Caractérisation et suivi du devenir intracellulaire de nanoparticules lipidiques (LNP) délivrant de l'ARNm.

1.            Tomishige, N., Takahashi, K., Pollet, B., Richert, L., Mély, Y. & Kobayashi, T. in Methods in Enzymology700, 217–234 (Elsevier, 2024).

2.            Kobayashi, T., Tomishige, N., Inaba, T., Makino, A., Murata, M., Yamaji-Hasegawa, A. & Murate, M. Impact of Intrinsic and Extrinsic Factors on Cellular Sphingomyelin Imaging with Specific Reporter Proteins. Contact4, 251525642110424 (2021).

3.            Tomishige, N., Bin Nasim, M., Murate, M., Pollet, B., Didier, P., Godet, J., Richert, L., Sako, Y., Mély, Y. & Kobayashi, T. HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane reorganizes sphingomyelin-rich and cholesterol-rich lipid domains. Nat Commun14, 7353 (2023).

4.            Dukhno, O., Przybilla, F., Collot, M., Klymchenko, A., Pivovarenko, V., Buchner, M., Muhr, V., Hirsch, T. & Mély, Y. Quantitative assessment of energy transfer in upconverting nanoparticles grafted with organic dyes. Nanoscale9, 11994–12004 (2017).

5.            Dukhno, O., Przybilla, F., Muhr, V., Buchner, M., Hirsch, T. & Mély, Y. Time-dependent luminescence loss for individual upconversion nanoparticles upon dilution in aqueous solution. Nanoscale10, 15904–15910 (2018).

6.            Dukhno, O., Ghosh, S., Greiner, V., Bou, S., Godet, J., Muhr, V., Buchner, M., Hirsch, T., Mély, Y. & Przybilla, F. Targeted Single Particle Tracking with Upconverting Nanoparticles. ACS Appl. Mater. Interfaces16, 11217–11227 (2024).